單克隆抗體簡介

1975年分子生物學家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術的基礎上，創建立雜交瘤技術，他們把可在體外培養和大量增殖的小鼠骨髓瘤細胞與經抗原免疫後的純系小鼠B細胞融合，成為雜交細胞系，既具有瘤細胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細胞的合成和分泌特異性抗體的特點。将這種雜交瘤作單個細胞培養，可形成單細胞系，即單克隆。利用培養或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結構、氨基酸順序、特異性等都是一緻的，而且在培養過程中，隻要沒有變異，不同時間所分泌的抗體都能保持同樣的結構與機能。這種單克隆抗體是用其他方法所不能得到的。

這項新技術從根本上解決了在抗體制備中長期存在的特異性和可重複性問題，可用于探讨

①蛋白質的精細結構；

②淋巴細胞亞群的表面新抗原；

③組織相容性抗原；

④激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析；

⑤腫瘤的定位和分類；

⑥純化微生物和寄生蟲抗原；

⑦免疫治療和與藥物結合的免疫-化學療法 (“導彈”療法,利用單克隆抗體與靶細胞特異性結合，将藥物帶至病竈部位。因此，單克隆抗體可直接用于人類疾病的診斷、預防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊前景。

單克隆抗體是由單一B細胞克隆産生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，将具有分泌特異性抗體能力的緻敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。

單克隆抗體是人工制備的雜交瘤細胞生産的，雜交瘤細胞是由一個經抗原激活後的B細胞與一個骨髓瘤細胞融合形成。單克隆抗體優點：純度高，靈敏度高，特異性強，交叉反應少，制備的成本低。缺點：對技術有一定的要求，而且通過抗原的化學處理很容易丢失表位 。

單克隆抗體制備過程

1. 免疫動物

免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠産生緻敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為緻敏B淋巴細胞。

2.細胞融合

采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾髒，在平皿内擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 将準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

3.選擇性培養

選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 隻有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。

4.雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，隻有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能産生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識别抗原的表位及其分子量後，及時進行凍存。

5.單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動物體内誘生法和體外培養法。

(1)體内誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周後，腹腔内接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔内增殖，并産生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養法 将雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞産生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法産生的抗體量有限。各種新型培養技術和裝置不斷出現，大大提高了抗體的生産量。

單克隆抗體抗原準備

抗原，是指能夠刺激機體産生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答産物抗體和緻敏淋巴細胞在體外結合，發生免疫效應（特異性反應）的物質。

抗原的基本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的産物發生反應，也就是抗原性。

很多物質都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見抗原，在進行單克隆抗體制備過程中，很多物質都可以成為抗原，在常規的科研實驗中，科研者經常選用每隻小鼠/大鼠每次注射10~50ug重組蛋白、偶聯多肽、偶聯小分子等作為抗原産生特異性的單克隆抗體。

1.動物免疫

單克隆抗體制備的宿主動物一般選用BALB/c小鼠，鼠單抗的應用範圍相當廣泛，一些國内外公司均開發出了兔的單克隆抗體制備技術。

免疫原分為可溶性抗原和顆粒性（細胞）抗原，用無菌鹽水稀釋并與佐劑混合，腹腔注射抗原與佐劑徹底混勻後形成的穩定乳狀液，在免疫原提供持續的免疫應答基礎上進行加強免疫

2.細胞融合

細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學融合法和生物融合法，如滅活的仙台病毒，此處例舉化學融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于1000時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱穩定，與許多化學藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應最高。也有采用30%～50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗後方可應用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。

3.融合過程

融合的方法很多，常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。

細胞融合關鍵

A．技術上的誤差常常導緻融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。

B．融合試驗最大的失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個無毒無菌的操作環境。

4.雜交瘤細胞

克隆化的細胞可以在體外進行大量培養，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養液。而體内雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細胞就開始無限地繁殖，直至宿主死亡。産生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養細胞上清液的100~1000倍。

利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細胞血清等，可以加速和促進腫瘤的生長。

單克隆抗體鑒定實驗

單抗的特異性鑒定可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印迹技術等，同時還需做免疫阻斷試驗等。

單抗的效價測定可采用凝集反應、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養上清液的效價遠不如腹水的效價。采用凝集反應，腹水效價可達5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養上清和腹水的稀釋度表示。

必要時還可以測定單抗的親和力和識别抗原表位的能力測定。

單克隆抗體克隆化方法

經過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養，進行克隆，以得到單個細胞的後代分泌單克隆抗體。克隆的時間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長，互相争奪營養和空間，而産生指定抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩定，數量少也易丢失。克隆化的陽性雜交瘤細胞，經過一段時期培養之後，也還會因為細胞突變或特定染色體的丢失，使部分細胞喪失産生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養。克隆化次數的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定。一般說，免疫性強的抗原克隆次數可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩定。克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平闆法及熒光激活分離法等。

單克隆抗體的應用

單克隆抗體問世以來，由于其獨有的特征已迅速應用于醫學很多領域。主要表現在以下幾個方面。

1．檢驗醫學診斷試劑

作為檢驗醫學實驗室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性好等優點，廣泛應用于酶聯免疫吸附試驗、放射免疫分析、免疫組化和流式細胞儀等技術。并且單克隆抗體的應用，很大程度上促進了商品化試劑盒的發展。

應用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應用于：

①病原微生物抗原、抗體的檢測；

②腫瘤抗原的檢測；

③免疫細胞及其亞群的的檢測；

④激素測定；

⑤細胞因子的測定。

單克隆抗體對抗原的識别，與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同，識别抗原的位點不同，導緻檢測結果有一定差異。因此，标準化問題還需要進一步研究。

2．蛋白質的提純

單克隆抗體是親和層析中重要的配體。将單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當樣品流經層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其餘成分不能與之結合。将層析柱充分洗脫後，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。

3． 腫瘤的導向治療和放射免疫顯像技術

将針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質連接，利用單克隆抗體的導向作用，将藥物或放療物質攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤導向治療。另外，将放射性标記物與單克隆抗體連接，注入患者體内可進行放射免疫顯像，協助腫瘤的診斷。單克隆抗體主要為鼠源性抗體，異種動物血清可引起人體過敏反應。因此，制備人-人單克隆抗體或人源化抗體更為重要，但此方面仍未取得明顯進展。

單克隆抗體的優勢和局限性

1．單克隆抗體的優點

(1)雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，隻要不發生細胞株的基因突變，就可以不斷地生産高特異性、高均一性的抗體。

(2)可以用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。

(3)由于可能得到“無限量”的均一性抗體，所以适用于以标記抗體為特點的免疫學分析方法，如IRMA和ELISA等。

(4)由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學功能，可用于體内的放射免疫顯像和免疫導向治療。

2．單克隆抗體的局限性

(1)單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用範圍。由于單克隆抗體不能進行沉澱和凝集反應，所以很多檢測方法不能用單克隆抗體完成。

(2)單克隆抗體的反應強度不如多克隆抗體。

(3)制備技術複雜，而且費時費工，所以單克隆抗體的價格也較高 。

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