基本方案1：堿裂解法制備粗制裂解物

01 實驗材料

• 含有氨苄青黴素或其他适當的選擇性試劑的LB培養基或豐富培養基（如超級肉湯或TB超級肉湯培養基)
• 帶有質粒的大腸杆菌菌株
• 葡萄糖/Tris/EDTA (GTE)溶液卵清溶菌酶
• NaOH/SDS 溶液
• 3 mol/L乙酸鉀溶液，pH 約5.5
• 異丙醇
• 70%乙醇
• 約20 ml容量的高速離心管

02 實驗步驟

1)往5 ml的含選擇性試劑（通常是氨苄青黴素）的LB培養基或豐富培養基接種單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過夜。

2)往2L燒瓶中加入 500 ml含有适當抗生素的LB培養基，然後加人1 ml過夜培養的大腸杆菌培養物，再于37℃培養至飽和狀态（OD600≈4)，于4℃，6000 g 離心10 min。

注意：為提高産量，應采用表面積較大及帶折流闆的燒瓶以盡量增大通氣度﹔振搖速度應大于400r/min。

3）用4 ml GTE溶液重懸沉澱，并轉移到一個容積≥20 ml的高速離心管中。

4)加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（終濃度5 mg/ml)，徹底重懸沉澱，于室溫放置10 min。

注意：如果 DNA要用層析法純化，加入50 ug/ml RNA酶A以降解RNA。

5）加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。

6)加入7.5 ml 3 mol/L乙酸鉀溶液，用吸管輕輕攪拌直至黏稠度下降并形成大的沉澱，于冰上放置10 min。

7)于4℃，20 000 g離心10 min，将上清輕輕倒入至另一個幹淨的離心管中，如果有可見的漂浮物可用數層紗布過濾。

8)加入0.6倍體積的異丙醇，颠倒混勻，室溫放置5~10 min。

9)室溫，15 000 g 離心10 min。棄上清，加入2 ml 70%乙醇輕輕洗滌沉澱。

10)室溫，15 000 g短暫快速離心，吸去乙醇，并真空幹燥。4℃無限期保存。

基本方案2：氯化铯/溴化乙錠平衡離心法

01 實驗材料

• 來自于粗裂解物制備的沉澱或上清
• TE緩沖液pH 7.5
• 氯化铯(CsCl)
• 10 mg/ml溴化乙錠溶液
• Dowex AG5OW-X8陽離子交換樹脂
• l g/ml CsCI/TE溶液
• 0. 2 mol/L NaCI/TE緩沖液100%乙醇和70%乙醇
• 5 ml 快封超離心管

02 實驗步驟

1）粗裂解物制備方案最後一步得到的沉澱溶于4 ml TE緩沖液中，加人4.4 g CsCl,溶解後，再加入0.4 ml 10 mg/ml溴化乙錠。

注意:溴化乙錠是一種誘變劑并能造成環境污染，操作時應戴手套，并且妥善處理。

2)将溶液轉入一個5 ml 的 quick-seal 快速封口的超離心管中，往管中加人1 g/ml CsCl/TE溶液，封好離心管。

3)于20℃，500 000 g 離心3.5 h或于20℃，以350 000 g 離心14 h 以上。

注意:必須在溫度不低于15℃下離心，這是為了防止對轉子和離心機的損壞以及潛在的嚴重的人員傷害。

4)小心地取出管子，從管的頂端插人一支20-G針頭，然後用帶另一20-G針頭的3 ml注射器将質粒帶吸出（針頭插入質粒帶下約1 cm)。

注意:為了防止紫外線對眼睛的嚴重損傷，應戴紫外防護眼鏡或面罩。操作溴化乙錠時要戴手套。

5）為了得到更高純度的質粒DNA，在新管中進行第二次超速離心，管頂加有含0.1mg/ml溴化乙錠的CsCl/TE緩沖液。

6）按質粒DNA/EB溶液的1.5～2倍體積裝 Dower AG50W-X8柱子，用數倍體積的TE/0.2 mol/L NaCl溶液清洗和平衡柱子。

7)用注射器将混合有溴化乙錠的質粒DNA溶液直接加到樹脂的頂部，注意不要搖動樹脂。立即收集流出液。

8）用2倍于上樣質粒溶液體積的0.2 mol/L NaCl /TE溶液洗脫柱子兩次，用同一管子收集流出液。也可以用等體積TE飽和的正丁醇來除去溴化乙錠。充分渦旋振蕩混勾，然後除去有機相，重複幾次直至在紫外燈下看不見紅色，然後加入3倍體積TE緩沖液來稀釋氯化铯。

注意：在本方法中産生的含有溴化乙錠的有機廢物應該妥善處理。

9)加入 2 倍體積100%乙醇于室溫或-20℃沉澱質粒DNA，于 4℃，以 10 000 g 離心10 min。沉澱 DNA時溫度不要低于-20℃，以免氯化铯沉澱下來。

10）沉澱用70%乙醇洗滌1遍，真空幹燥,溶解于TE緩沖液，并于4℃保存。

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